O cérebro humano, célula por célula

22/05/2012 at 2:12 PM Deixe um comentário

HERTON ESCOBAR , ENVIADO ESPECIAL / RIO – O Estado de S.Paulo

Cientistas no Rio usam cérebros de São Paulo para estudar o envelhecimento

 

O cérebro humano tem a consistência de um pudim.

 Penso nisso enquanto assisto à pesquisadora Ana Virgínia Oliveira Pinto dissecar um no Laboratório de Neuroplasticidade do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro (ICB-UFRJ). Com uma pinça, ela descola a pia-máter, uma membrana vascularizada que reveste o cérebro como uma embalagem. Depois, armada de faca e bisturi, desmonta o órgão em várias estruturas anatômicas, como cerebelo, hipocampo, lobo frontal e outras regiões do córtex.

As lâminas deslizam com facilidade pelo tecido mole. Difícil e incrível é imaginar que aquela massa enrugada e de aparência gelatinosa já foi a “cabeça pensante” de alguém, com uma vida inteira de informações armazenadas na forma de sinapses e neurotransmissores.

Cada pedaço dissecado é pesado e congelado separadamente para, mais tarde, ser desintegrado e transformado numa “sopa” de organelas celulares. Coisa que Virgínia já fez com 24 cérebros desde o início do ano passado e pretende fazer com mais algumas dezenas até o final do seu doutorado, em 2013.

O objetivo: entender como a arquitetura celular do cérebro se desenvolve e se modifica ao longo da vida, do nascimento até a morte. “Em que momento o cérebro se torna maduro, totalmente desenvolvido? Não sabemos. E a partir de que momento ele começa a se degenerar, perder neurônios? Também não sabemos”, diz Virgínia. “Queremos conhecer a dinâmica desse processo, observar toda essa evolução cerebral.”

O cérebro fatiado à nossa frente pertencia a um homem de 49 anos, morto por edema pulmonar em São Paulo, no fim de março. Um dos quatro casos que Virgínia acabara de trazer do Banco de Encéfalos Humanos da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (mais informações na página ao lado). Os outros três vieram de um homem de 86 anos, uma mulher de 57 e outra, de 55. Quanto mais variadas as idades, para Virgínia, melhor. A ideia é justamente comparar a composição celular dos cérebros de homens e mulheres de várias idades, para ver se há diferenças significativas entre eles.

“O que queremos, essencialmente, é estabelecer a linha de base do desenvolvimento e do envelhecimento cerebral”, explica o neurocientista Roberto Lent, orientador de Virgínia, chefe do laboratório e diretor do ICB. “Para entender as alterações, precisamos antes entender a linha de base.”

Em outras palavras: para diagnosticar o que é anormal, é preciso, antes, estabelecer o que é normal. Por isso, a pesquisa é feita apenas com cérebros de pessoas consideradas saudáveis do ponto de vista neurológico, sem sintomas de doenças neurodegenerativas, como Parkinson ou Alzheimer, nem de outras condições capazes de causar alterações na estrutura cerebral. “Tudo que possa alterar o número de neurônios a gente exclui. Selecionamos a morte mais natural possível”, diz a pesquisadora Ana Tereza Di Lorenzo Alho, do Banco de Encéfalos Humanos da USP, responsável pela triagem e processamento dos casos que são enviados para a UFRJ.

Sempre que aparece um cérebro que se encaixa no protocolo da pesquisa carioca, Tereza avisa Virgínia, que vai buscar o órgão em São Paulo. Ela leva um hemisfério inteiro de cada cérebro, preservado em formol, mais algumas amostras “frescas” (sem formol) de quatro regiões do outro hemisfério – que permanece no banco em São Paulo para ser usado em outras pesquisas. As amostras frescas são utilizadas para análises de alteração cromossômica, enquanto os tecidos fixados em formol são usados para contagem de células – o parâmetro básico de comparação usado em várias pesquisas do laboratório.

Receita nacional. A técnica de contagem celular, chamada fracionamento isotrópico, foi inventada na própria UFRJ sete anos atrás por Lent e Suzana Herculano-Houzel, sua parceira de pesquisa e vizinha de laboratório no ICB. O processo consiste em desintegrar o tecido cerebral por uma combinação de ações químicas e mecânicas, que rompem a membrana das células, mas não a membrana dos seus núcleos, produzindo ao final uma “sopa” homogênea de organelas celulares – tendo núcleos intactos como ingrediente principal.

Um processo relativamente simples, mas trabalhoso, que envolve macerar pequenas amostras de tecido (de no máximo 6 gramas cada uma) em pilões de vidro chamados potters. Para fracionar um lobo posterior do cerebelo, por exemplo, uma estrutura de apenas 60 gramas, leva-se cerca de 10 horas. Um meio cérebro inteiro, de 600 gramas, consome praticamente um mês e meio de trabalho. E isso graças à invenção de uma máquina, em 2010, que reduziu o tempo de fracionamento pela metade. Antes, os alunos tinham de macerar as amostras manualmente durante dias, e não eram raros os casos de tendinite no laboratório por causa disso.

Segue-se, então, uma rotina de procedimentos meticulosos e tediosos, medidos em segundos, milímetros e microlitros, mas que podem render grandes e fascinantes descobertas no final.

Pronta a sopa de organelas, acrescenta-se a ela uma substância chamada DAPI, uma espécie de corante molecular fluorescente que se liga exclusivamente aos núcleos celulares, fazendo eles brilharem como bolinhas azuis no microscópio. Dessa mistura, tira-se uma amostra de 0,04 mililitro, subdividida em quatro subamostras ainda menores, de 0,01 mililitro, que são colocadas sobre uma plataforma chamada câmara de Neubauer – uma placa de vidro com um grid de quadrados milimétricos, que servem como referência para a contagem dos núcleos. “Como cada célula tem um único núcleo, contar núcleos equivale a contar células”, explica Lent.

Sabendo o volume das amostras, a área dos quadrados, o número de núcleos que aparecem dentro deles, e aplicando algumas fórmulas matemáticas, os cientistas conseguem determinar quantas células havia no pedaço original de cérebro que foi fracionado.

E tem mais. Para saber quantas dessas células são neurônios – versus outros tipos de células cerebrais – é preciso acrescentar à amostra um segundo marcador molecular, que reage apenas com os núcleos de neurônios, fazendo com que eles fluoresçam vermelho. A regra básica é contar 500 núcleos azuis e ver quantos deles brilham também em vermelho, para obter uma proporção estatística. Detalhe: as cores não podem ser visualizadas simultaneamente; é preciso trocar manualmente os filtros de azul e vermelho para cada campo de visualização no microscópio.

Os cientistas já sabem – graças a essa técnica – que a proporção entre neurônios e não neurônios varia bastante entre as regiões cerebrais. No córtex, por exemplo, só 20% das células são neurônios, em média, enquanto no cerebelo esse índice é de 80%. Em breve, Virgínia poderá dizer também se há variações relacionadas ao sexo e à idade.

Fracionar e contar as células de cérebros inteiros levaria muito tempo, por isso ela optou por focar a pesquisa em três regiões: cerebelo, bulbo olfativo e formação hipocampal. O hipocampo, associado à memória, e os bulbos, associados ao olfato, são as duas regiões onde há neurogênese (formação de novos neurônios) comprovada na vida adulta. Já o cerebelo, associado a funções cognitivas e motoras, concentra 80% dos neurônios do cérebro em apenas 10% da massa encefálica total – um alvo irresistível de pesquisa.

No processo de dissecação, todo cuidado é pouco para não perder nenhum fragmento do tecido cerebral, por mais microscópico que seja. Cada vez que separa um pedaço do órgão num recipiente, Virgínia enxágua as luvas e as lâminas usadas na operação com uma solução, para que qualquer célula que tenha ficado grudada nelas escorra para dentro do mesmo recipiente. “Para ter uma contagem absoluta não podemos desperdiçar nenhuma célula”, justifica ela, recuperando da mesa um fragmento do tamanho do um grão de arroz. “Você não imagina a quantidade de células que tem num pedacinho desses. Especialmente se for do cerebelo.”

Órgão doce. Outra preocupação é com as formigas que costumam invadir a bancada, talvez atraídas pelo conteúdo adocicado dos cérebros. “É só a gente começar a dissecar que elas aparecem”, conta Virgínia. O cérebro humano tem um metabolismo altíssimo – consome 20% da energia total do corpo – e por isso precisa de muita glicose (açúcar) para funcionar. Poderia se dizer, talvez, que é nosso órgão mais doce.

A meta de Virgínia é fracionar pelo menos cinco cérebros de cada faixa etária, separadas por década. Ela já tem 39 cérebros coletados, mas apenas quatro abaixo dos 50 anos e um, acima dos 90. Os mais jovens são os mais difíceis de conseguir, pois o Serviço de Verificação de Óbitos (que fornece os órgãos para o Banco) só lida com mortes de causas naturais, que são mais comuns em idades mais avançadas.

Outras linhas de pesquisa no laboratório, baseadas na contagem de células, incluem a comparação entre cérebros de pessoas com Alzheimer – em diferentes estágios da doença – e entre bulbos olfativos de homens e mulheres de diferentes idades. Algumas pesquisas estão bem avançadas, com resultados preliminares instigantes, mas Lent prefere não divulgar nada até que os dados estejam consolidados e publicados – especialmente com relação às diferenças entre homens e mulheres.

“Melhor não criar polêmica antes da hora”, diz o cientista, cauteloso. “Está pintando uma diferença, mas não podemos afirmar isso ainda.” A expectativa é publicar vários resultados ainda neste ano. Até lá, o consumo de açúcar na cabeça dos cientistas promete ser grande.

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